㈠ 脾细胞

1．材料

⑴ 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。

　　⑵ 1640培养液

⑶ 2.5%FCS－1640营养液

　　2．操作方法

　　⑴ 拉颈或用CO2处死小白鼠。

　　⑵ 将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。

　　⑶ 把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

　　⑷ 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

　　⑸ 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。

　　⑹ 以2.5%FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。

　　⑺ 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

　　⑻ 重复⑹、⑺步骤。

　　⑼ 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格。

　　㈡ 骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

　　选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2/0—Ag14（简称SP2）；③P2—X­—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤。取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。

　　㈢ 饲养细胞

　　在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

　　1．材料

　　⑴ 小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。

　　⑵ 11.6%蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。

　　2．操作方法

　　⑴ 拉颈处死小鼠。

　　⑵ 70%酒精浸泡消毒10min。

　　⑶ 用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

　　⑷ 用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

　　⑸ 1000r/min离心10min。

　　⑹ 取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。

　　⑺ 以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。