一、实验室研究进展

目前本实验室利用SSR分子标记方法对长江流域大面积推广种植的湘杂棉系列品种及其亲本材料进行研究，已经取得了如下研究成果：

1．建立了适应于棉花的SSR扩增体系：反应总体积为10μl，其中含有Mg2+(25mM) 0.4μl，dNTPs(10mM) 0.2μl，上下游引物(10μM)各0.6μl，TaqDNA聚合酶(1U/μl) 0.5μl，10×Reaction buffer 1.0μl，模板DNA(50ng/μl) 0.5μl，ddH2O 6.2μl；采用8%聚丙烯酰胺电泳，稳压180V，70分钟；采用改进银染法染色。

2．初步尝试构建了湘杂棉的指纹图谱：目前已经从陆地棉26对染色体上挑选了331对SSR引物进行筛选，筛选出了31在湘杂棉系列品种中显示多态性的引物，占检测引物的9.37%。并从中挑出19对多态性较好、条带易读取的引物，构建了湘杂棉指纹图谱。

3．湘杂棉种子纯度的检测：筛选出湘杂棉系列中5个品种（湘杂棉2号、湘杂棉4号、湘杂棉5号、湘杂棉6号、湘杂棉10号）的共显性引物，可以用于这些品种的纯度检测。

4．未知种身份的识别：利用构建好的指纹图谱，通过遗传相似系数的计算和聚类分析比较，可以进行未知种身份的识别。

二、 细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉花抗病增产的作用机制及其基因对棉花遗传转化的研究

1、细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗基因表达差减文库EST分析

利用细极链格孢菌蛋白激发子粗提蛋白液诱导棉花苗期相关基因表达，以清水喷施为对照样本，进行抑制差减杂交，构建棉花苗期基因表达文库。结果显示，插入片段的大小主要集中在200bp～1kb之间。随机选取150个克隆进行菌液PCR检测与测序，并将所测序列与 GenBank dbEST 库进行比对，共得到104个单一序列。其中，78个EST与其它物种已知基因部分区域的同源性为48.54%～100%，占总EST的75%；6条EST序列能在数据库中检索到同源性序列，但其功能尚不清楚，占5.77%；10个EST能在数据库中发现为推测蛋白，占9.6%；10个EST在GenBank中没有查到对应的同源序列，可能是新基因，占9.6%。同时，将所得到的104条EST序列在 WEGO网站上进行功能分类，通过Gene ontology 确定具体EST的分子功能。其中，在生物途径分类中，与生理途径和细胞过程相关的EST最多，分别为48个、45个；在细胞组份功能分类中，与细胞相关的EST最多，达到44个；在分子功能分类中，催化功能与分子绑定相关的EST数量最多，分别达到了30个、28个。由此可见，细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗时涉及到植物的生理生化的多条途径，受到多个基因的调控，可能包括抗病与防御蛋白，信号传导蛋白，转录因子，能量代谢相关蛋白，抗逆相关蛋白，细胞保护机制蛋白，功能未知及其它蛋白等相关蛋白。

2、双向电泳联用质谱技术研究细极链格孢菌蛋白激发子对棉苗诱导的应答

采用双向电泳和质谱技术分析了细极链格孢菌蛋白激发子对棉苗诱导的全蛋白质组，建立二者间的差异表达图谱，并对差异蛋白进行了鉴定以及分析归类。结果表明,蛋白质分子质量在10～100 KD之间、等电点3～10范围内,每块胶分离到约600个蛋白质点。得到了大约53个差异蛋白点，其中有31个为上调蛋白，22个为下调蛋白。对PEAT诱导后表达量明显增加的 7个上调蛋白点用用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行肽质量指纹谱的分析,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测，获得了4个蛋白的肽质量指纹图谱，经数据库检索鉴定分析，GH-1、GH-3、GH-6推测为核酮糖1，5-二磷酸羧化酶基因家簇，GH-7推测为 S-腺苷一蛋氨酸合成酶。

3、细极链格孢菌蛋白激发子对棉花黄萎病的防效机制研究及转基因抗黄萎病材料创造

植物抗病性的强弱取决于抗病基因的表达速度和强度。PEAT的诱导，快速开启了同抗性有关的基因的表达，增强了这些基因表达的速度和强度，因而开启了原先处于蛰伏状态的防御机制，从而使棉株表现出一定的抗病性。本实验中，细极链格孢蛋白激发子对棉株诱导后，表现为SOD、POD、PPO、几丁质酶活性增高，MDH含量降低，表明PEAT诱导后，可能是通过调节SOD、POD等参与的AOS代谢，减轻了膜脂过氧化造成的自身伤害，同时，强化苯丙烷类代谢途径，产生植保素、酚类化合物等抗菌物质，使植物体内病程相关蛋白含量升高，诱导了系统抗性，在一定程度上控制了病害的发生和发展，这可能是PEAT诱导抗黄萎病的机制之一。

利用从PEAT中克隆的pem^g1基因，成功地构建了可用于转化棉花的表达载体 pBI121- pem^g1和 PCAMBIA- pem^g1，用花粉管通道法转化陆地棉品种Z-1、Z-2、Z-3，获得了转基因植株，其中，pBI121- pem^g1获得Kan^r植株48株，PCAMBIA- pem^g1获得bar^R植株10株。同时，对转基因棉花材料进行 PCR 分子生物学检测, Kan抗性植株中确定外源pem^g1基因已整合到受体植株的基因组中有6株,而bar^R抗性植株中仅有3株。